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免疫沉淀没有它无法实现

发布时间:2021-1-4 17:17:46      点击:

  今天要来讲讲离心机在免疫沉淀方面得重要性。

  据了解染色质免疫沉淀简称ChIP用来研究DNA上的特定蛋白质。

  而RNA免疫沉淀法(RIP)和ChIP相近,但RNA免疫沉淀法是用来研究会与RNA结合的蛋白质(RNA Binding ProteinImmunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,利用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,通过离心机分离纯化,对结合在复合物上的RNA 进行RT-PCR验证或测序分析,了解转录后调控网络动态过程,是研究转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

  RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等)。

  RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip,帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化,结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。

  免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子国际,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,通过离心机离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

  免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

  免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。

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  操作步骤

  1.一般起步使用2个10cm2皿,用预冷的PBS洗涤细胞三次,最后一次吸干PBS;

  2.加入细胞裂解液(western及IP裂解液)裂解细胞,使蛋白终浓度在1-7mg/ml;

  3.4°离心10min,去除细胞碎片;注意这里需要用到手机离心机,因为官网上有严格要求。

  4.根据样品量加入0.5-2ug左右抗体,4℃,旋转过夜。

  5.取10-30ul protein A/G 的beads于EP管中,弃上清,使用PBS洗涤beads一次。

  6.将样品加入EP管,4度垂直混匀2-3h。(在吸取琼脂糖珠的时候,注意要摇匀管子,让珠子和溶液混合均匀,同时黄枪头要减掉头子再吸取,以免破坏珠子),PBS洗脱;4度离心,弃上清,

  7.洗脱三次,酌情用PBS/PBST/高盐溶液洗琼脂糖珠,最后一次吸干洗涤液。

  8.将适量相应抗体的多肽或0.1M PH2.8的甘氨酸稀释到细胞裂解液中,混匀,取适量于beads中进行洗脱,去除轻重链。若用甘氨酸HCL,样品需要用NaOH中和,根据C1V1=C2V2计算加入NaOH的含量。

  9.通过离心机离心取上清,制样,跑胶。

  以上就是关于离心机在免疫沉淀方面得讲解,现在您知道“免疫沉淀没有它无法实现”中得"它"说的是什么了吧!


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